VHL2/2、APP、CamkIIα-Cre转基因小鼠模型的建立开题报告

 2023-02-12 12:02

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

阿尔兹海默病（Alzheimers disease，AD）是一种由神经系统变性引发的进行性痴呆，以大脑皮层颞叶和额叶萎缩为显著特征，典型的三大病理特征为：神经原纤维缠结、老年斑以及神经元的广泛缺失。

老年者发病率较高，亦称老年痴呆。

临床表现以记忆障碍、认知功能障碍、精神症状以及人格、行为方面的异常为主，病程可长达数年至数十年。

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2. 研究的基本内容和问题

1、项目研究的目标将小鼠VHL敲低，然后再用VHL敲低的小鼠跟阿尔茨海默病模型小鼠（APP转基因小鼠，点突变的APP是早发性AD的主要病因）杂交，得到VHL基因敲低的阿尔茨海默病模型小鼠，然后分析VHL对APP的加工过程及对老年斑产生的影响。

2、项目研究的内容1）购买VHL2/2小鼠、CamkII-Cre小鼠以及APP转基因小鼠；2）将VHL2/2小鼠同CamkII-Cre小鼠和APP转基因小鼠进行交配，获得VHL2/2、CamkII-Cre小鼠和VHL2/2、APP小鼠；3）将VHL2/2、CamkII-Cre小鼠和VHL2/2、APP小鼠进行交配，获得VHL2/2、CamkII-Cre、APP小鼠； 4）Tamoxifen诱导一月龄大VHL2/2、CamkII-Cre小鼠；5）预实验：取VHL2/2、CamkII-Cre小鼠的海马、大脑皮层，检测四月龄VHL2/2、CamkII-Cre小鼠Cre酶诱导后VHL2/2的敲除效果。

6）取VHL2/2、CamkII-Cre、APP小鼠的海马、大脑皮层，western检VHL2/2敲低前后APP的量；7）脑组织中Aβ等病理组织学的观察；3、拟解决的关键问题获得VHL2/2、CamkII-Cre小鼠，并用Tamoxifen进行诱导，获得VHL2/2敲低的小鼠，然后再用VHL敲低的小鼠跟阿尔茨海默病模型小鼠（APP转基因小鼠，点突变的APP是早发性AD的主要病因）杂交，得到VHL基因敲低的阿尔茨海默病模型小鼠，然后分析VHL对APP的加工过程及对老年斑产生的影响。

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3. 研究的方法与方案

(1)研究方法1)实验动物及采样购买VHL2/2小鼠、CamkII-Cre小鼠以及APP转基因小鼠，将VHL2/2小鼠同CamkII-Cre小鼠和APP转基因小鼠进行交配，获得VHL2/2、CamkII-Cre小鼠和VHL2/2、APP小鼠；将VHL2/2、CamkII-Cre小鼠和VHL2/2、APP小鼠进行交配，获得VHL2/2、CamkII-Cre、APP小鼠； Tamoxifen诱导一月龄大VHL2/2、CamkII-Cre小鼠，一星期内进行三次腹腔注射（5mg/只）。

Tamoxifen（20mg/ml）的配置方法：A. 在15ml离心管中42℃加热10ml玉米油（Sigma，C-8267）30min；B.称取200mg Tamoxifen加入5ml玉米油中，用铝箔纸包裹tube管以避光，并涡旋；C.37℃水浴溶解Tamoxifen，期间不间断进行涡旋，数小时内溶解；D.4℃保存。

将四月龄大的VHL2/2、CamkII-Cre小鼠，VHL2/2、CamkII-Cre、APP小鼠乙醚麻醉处死，取小鼠海马、皮层，皮层一半、海马组织匀浆，皮层另一半过液氮，冻于-80℃。

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4. 研究创新点

APP是困扰老年人的一种重要的疾病，而VHL疾病也同样危害着人类的健康，VHL综合征包括即CNS血管母细胞瘤合并肾脏或胰腺囊肿、嗜铬细胞瘤、肾癌以及外皮囊腺瘤等疾病。

目前有关APP和VHL的研究都较为深入并不断完善。

本项目的创新之处在于将APP的研究同VHL相结合，构建了VHL2/2被敲低的APP小鼠动物模型，在动物水平进一步证明VHL在小鼠模型中对APP降解和Aβ产生的影响，增进有关APP研究的完整性。

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5. 研究计划与进展

①本实验设计希望能够得到VHL基因敲低的阿尔茨海默病模型小鼠，然后分析VHL对APP的加工过程及对老年斑产生的影响。

实验室已在细胞水平验证VHL的过表达促进APP经溶酶体途径降解，减少Aβ的产生。

通过已有的实验结果预测，在小鼠大脑中，VHL能够减少Aβ的产生，在一定程度上抑制AD的发生和发展。

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