猪圆环病毒2型NJ株Cap蛋白基因表达载体的构建与表达开题报告

 2023-02-12 12:02

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪圆环病毒病(porcinecircovirusdesease，PCVD)是近十多年年新发现的一种猪的传染病，由猪圆环病毒(PorcineCircovirus，PCV2)引起猪的一种多系统功能障碍性疾病[1]。该并首次证实于1997年加拿大西部，之后北美、欧洲、亚洲都有该病的报道[2-4]。猪圆环病毒(PCV)在分类上属圆环病毒科、圆环病毒属，不引起细胞病变，该病毒无囊膜，病毒粒子对外界自然环境的抵抗力较强[5]。PCV的基因组仅由单股负链闭环状DNA组成，因而不容易发生基因突变。呈20面体对称，平均直径17nm，是迄今发现的一种最小的动物病毒[6]。病毒基因组包含有3个主要的开放阅读框（ORFs），ORF1编码Rep蛋白，参与病毒的复制；ORF2编码Cap蛋白，是主要结构蛋白，也是病毒保护性抗原主要成分,因而具有较好的免疫原性，是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原；ORF3编码一种与细胞凋亡相关的蛋白，其免疫功能尚不明了[7]。本文主要对Cap蛋白基因因进行克隆和原核表达研究，并证实其具有良好的免疫活性，为ELISA试剂盒和单克隆抗体制备打下基础，从而为我国PCV2的防治乃至今根除作出贡献。

临床上，PCV-2感染除了引起猪断奶后多系统衰竭综合征PMWS之外，另外还与猪皮炎与肾病综合征、猪先天性震颤、母猪繁殖障碍、猪呼吸道疾病综合征等疾病相关[8]。据研究，。大群猪的发病率为4％-25％。但是病死率却高达90％以上。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为本病是继猪繁殖与呼吸综合征之后新发现的重要的猪的传染病。近期国内各地临床发病调查情况表明，猪圆环病毒病在我国规模化猪场的发病猪群越来越多，PCV一2抗体阳性率平均达42．9％，个别地区的猪场感染率可达80％以上给不少猪场造成了巨大的经济损失[9]。因此,PCV2已经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一。

PCV2防治的关键是建立实用的PCV2免疫检测技术,因而表达并纯化出PCV2特异性抗原具有重要意义。以Cap蛋白重组蛋白产物产量高、易纯化，因而能广泛运用。应用其表达产物建立的ELISA诊断方法可有效鉴别诊断PCVl和PCV2感染，从而用于流行病学调查。因此PCV2ORF2的研究也就成了PCV研究的热点。

本实验主要研究运用扩增出Cap蛋白基因，在原核系统中表达、纯化，免疫学方法对纯化的表达产物进行鉴定，测定其反应原性，可以为以后的ELISA试剂盒的制备和疫苗制备打下基础。

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2. 研究的基本内容和问题

研究目标

猪圆环病毒2型NJ株Cap蛋白基因原核表达载体的构建与表达

研究内容

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3. 研究的方法与方案

研究方法

利用PCR技术从临床病料中提取病毒DNA,扩增出猪圆环病毒PCV-2核衣壳蛋白（cap）基因。将其克隆到原核表达载体pET-32a中，构建了表达载体pET-H2转化至大肠杆菌BL21中，用ITPG诱导表达。重组蛋白用SDS-PAGE分析可溶性，用western-blotting分析其免疫反应性。

技术路线见附件

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4. 研究创新点

特色或创新之处

应用的原核表达系统，是比较经济、快捷的手段

以Cap蛋白重组蛋白产物产量高、易纯化

5. 研究计划与进展

2013.2.20-2013.3.9：了解实习内容，熟悉试验流程，学习试验方法，练习试验操作，撰写开题报告。

2013.3.10-2013.3.24：阅读文献，设计引物，PCR扩增

2013.3.25-2013.4.13：重组表达质粒的构建与鉴定

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