猪流行性乙型脑炎病毒蛋白EDⅢ单克隆抗体的表位鉴定研究开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

一、概述

流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）简称乙脑，是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起，主要侵害中枢神经系统的一种人畜共患自然疫源性急性传染病。人感染后死亡率高，常留有神经-精神后遗症。流行性乙型脑炎由蚊虫传播，对猪可引起繁殖障碍，造成养猪业的巨大经济损失，同时，猪也是JEV的中间宿主，带毒猪是本病的主要传染源。我国农业部1999年将猪流行性乙型脑炎归为二类动物疫病。

1871年，JE在临床上有了最初的认识，1924年，流行性乙型脑炎病毒在日本东京医院1名死于脑炎的19岁男子的脑组织中首次分离得到。在此次流行中有约600人发病，病死率高达60%。1935年在日本人群众流行本病时，用小鼠由病马脑组织中分离到病毒，进而证明这种病毒的性状与从人脑中分离的病毒完全一致。随后又在猪、牛、山羊等多种动物体内分离到同样的病毒，故称日本脑炎病毒。同年，中国第一次爆发JE，并于1940年正式分离得到病毒。1949年定名为流行性乙型脑炎（简称乙脑）。

乙脑是病毒性脑炎中病死率最高的，全世界每年大约有50000例乙脑发病，其中15000例死亡。该病主要分布在东南亚和太平洋西部地区，并有逐步扩大的趋势，一些原来为非乙脑流行的国家地区也发现了乙脑流行。据报道，该病每隔十年就会发生一次大规模流行。我国是乙脑发病人数最多的国家，主要分布在除新疆、青海、西藏和东北北部外的所有省和自治区。我国的乙脑病例每年有2万多例，病死率10%以上，幸存者有15.3%留有不同程度的后遗症。

二、病原和流行病学

JEV属黄病毒科黄病毒属，病毒粒子呈球形，直径约30-40nm，是黄病毒科最小的病毒之一，20面体对称，为单股RNA病毒，基因组长度11kb（10976bp）。在CsCl中的浮密度为1.24-1.25g/cm³，沉降系数200s，分子质量约为3000kD。有囊膜，E蛋白是囊膜主要蛋白，提纯的囊膜突起具有血凝活性。其血凝谱较广，血凝素的主要成分是多肽，能凝集鹅、鸽、绵羊和雏鸡的红细胞，但血凝素易被破坏，血凝反应要求有比较严格的pH域，仅6.4-6.8之间。

JEV在外界环境中的抵抗力不强，碘酊、来苏尔、甲醛等常用消毒药都具有迅速灭活作用。对热抵抗力弱，在56℃，30min或100℃，2min可被灭活，在-20℃可保存一年，可降低毒价，故一般在-70℃条件下保存毒株。若将感染病毒的脑组织加入50%甘油缓冲盐水中贮存在4℃，其病毒活力可维持数月。病毒的存活时间与稀释剂的种类和稀释程度有很大的关系，病毒的稀释度越高，病毒死亡越快。

长期以来，JEV跨地区传播的机理未明，最近认为可能与风、鸟类的迁徙等有关。

自然界约60多种动物可感染JEV。猪是人类感染传播循环里重要的环节，同时是主

要的传染源。JE流行区，禽畜的隐性感染率均很高，国内许多地区的禽畜血清抗体阳性检出率都在90%以上。

JEV主要通过带病毒的蚊虫叮咬传播。病毒的传播循环是在越冬动物及易感动物间通过蚊虫叮咬反复进行的，因此蚊子不仅是传播媒介，也是病毒的贮存宿主。猪还可经胎盘垂直传播给胎儿。

JEV的易感动物种类很多，人、马属动物、猪、羊、骆驼、狗、猫、鸡、鸭以及许多野生动物和鸟类均有易感性，并都可能出现病毒血症。但除人、马和猪外,通常不呈现临床症状。其实即使是人、马和猪,绝大多数也是呈隐性感染。

三、基因组结构和功能

JEV基因组为单股正链RNA分子，其长度为11kb（10976bp），5端95个核昔酸和3端585个核苷酸为非编码区,而剩余10296核苷酸形成单一开放阅读框(ORF),可编码含3432个氨基酸的多蛋白前体,无亚基因结构。该蛋白经酶切后可形成核衣壳蛋白(C)、囊膜蛋白(E)、膜前体/膜蛋白(PrM/M)的结构蛋白和NSI，NSZa，NSZb，NS3，NS4a，NS4b和NS5的非结构蛋白。

（一）结构蛋白

1、核心蛋白（Capsid，C）：是JEV的核衣壳蛋白，分子质量约为14kD,由120个氨基酸残基组成，但多为碱性氨基酸，富含带正电荷的Lys和Arg（约20%），这有利于C蛋白与基因RNA结合组成核心。C蛋白保护基因组RNA酶的分解和其他因素引起的损伤。

2、膜蛋白（membrane，M；precursor M[prM]）：是第二个被编码的蛋白，分子量约为8.3kDad，由75个氨基酸组成，由其前体蛋白PrM切割而成。其前体蛋白PrM(18.5kDa)存在于感染细胞内未成熟的毒粒中,病毒藉此与细胞相联。M蛋白是完全疏水的，参与病毒囊膜的构造，是病毒囊膜主要结构成分之一，被包埋在囊膜的脂质双层中，它可能与插入脂双层的E蛋白完全疏水性C端相互作用。M蛋白对维持E蛋自空间结构是必需的。Takegami等对其生物学功能进行了研究,认为M蛋白参与病毒的感染过程，prM是病毒诱发保护性免疫的重要协同成分,M蛋自能诱生具有轻度中和作用的抗体。

3、囊膜蛋白（Envelope，E）：是病毒主要的结构蛋白，是主要的抗原成分。由500个氨基酸残基组成,该蛋白是JEV的重要抗原蛋白,具有与细胞表面受体结合的能力并诱导机体产生中和抗体,因此E蛋白与病毒毒力、致病性和免疫保护等密切相关。

1999年Kolaskar等通过对E蛋白抗原表位的三维结构预测，认为E蛋白的三维结构主要由3个结构域组成，DomainⅠ带有血清学及生物活性的抗原表位；DomainⅡ具有中和活性和血凝活性抗原表位；DomainⅢ独立地在病毒表面折叠成为免疫球蛋自样结构，由于这种构象，许多抗原中和表位都集中于此结构域。

（二）非结构蛋白

有五个部分，为NS1、NS2、NS3、NS4、NS5。非结构蛋白大多数是酶式调节蛋白，

与病毒的复制、生物合成以及颗粒组装和的释放有关。

四、乙脑病毒单克隆抗体

单克隆抗体(monocfonalantibody,MAb)是指针对同一个抗原表位，结构与特性完全相同的高纯度的单一抗体。单克隆抗体制备技术因其很强的特异性和专一性，尤其是单抗的人源化技术的发展，广泛地运用于生物学及医学的各个领域。在乙型脑炎病毒的检测中，杂交瘤细胞技术和单克隆抗体技术在ELISA、中和试验、免疫突光、免疫胶体金试剂盒、噬菌体展示技术等方面起到了举足轻重的作用。中和性的单克隆抗体则在疫苗及检测试剂盒的开发研制方面具有巨大的潜力。单克隆抗体具有高度的敏感性和特异性等优点，将单抗与基因定位、氨基酸定位、基因重组技术结合起来，把抗原蛋白定位到分子水平，分析细胞表面小分子抗原结构，分析体内免疫反应机制及免疫调节水平是今后单克隆抗体研究的方向之一。

抗E蛋白的单抗有很高的中和活性,通过影响病毒与细胞膜的相互融合,阻止病毒进入细胞内,从而对乙脑病毒的感染有很强的保护作用。

参考文献

[1]Yaoming Li, Lidan Hou, Jing Ye,et al Development of a convenient immunochromatographic strip for the diagnosis of infection with Japanese encephalitis virus in swine[J].Jowrwa/ of Virological Methods, 2010,168: 51-56

[2]Amanda E. Calvert,Gavreel F. Kalantarov,Gwong-Jen J. Chang, et al Human monoclonal antibodies to West Nile virus identify epitopes on theprMprotein{i'\. Virology, 2011, 41:30-37

[3]项秉懿,陈苏民.乙型脑炎病毒的分子生物学研究进展[J].中国病毒学,1993,8(3): 199-206

[4]Prasad S R,Kumar V, Marwaha R K,et al. An epidemic of encephalitis in Haryana: serological evidence of Japanese encephalitis in a few patients[J]. Indian Pediatr, 1993, 30(7):905-910

[5]Vaughn DW,HokeCH.The epidemiology of Japanese encephalitis:prospects for Prevention[J].Epidemiol Rev,1992,14(l):191-221.

[6]Monath TP.Japanese encephalitis a plague of the Orient[J].N Engl J Med. 1988,319(10):614-643

[7]Tiroumourougane SV,Raghava P and Srinivasan S.Japanese Viral Encephalitis[J].Postgrad Med J,2001,78(918):205-215

[8]Young MS.Japanese Encephalitis Immunization in South Korea:past Present and future[J].Emerg Infect Dis,2000,6(1):17-24

[9]彭颖,余光开.流行性乙型脑炎的流行病学[J].医学综述,2007,13(2):122-124.

[10]汤德元,郭万柱.日本乙型脑炎病毒及其疫苗的研究[J]中国兽医学报,2005,25(2):217-219

[11]吴玉水,马文煌,朱忠勇.日本脑炎病毒基因疫苗研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志,2002,18(5):512一514.

[12]Kolask AR,Kulkarni-Kale U.Prediction of three diemensional structure and mapping of conformational epitopes of envelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus[J].Virology,1999,261(J):31-42

[13]Self SA,Morita K,Matsuo S,et al.Finer mapping of neutralizing epitopes on the C-terminal of Japanese encephalitis virus E-protein expressed in recombinant Escherichia coli system[J].Vaccine,1995,13(16):1515-1521

[14]Lin CW.A functional epitope determinant on domain Ⅲ of the Japanese encephalitis virus envelope protein interacted with neutralizing-antibody combining sites[J].J Virol,2003,77(4):2600-2606