传染性法氏囊病病毒（IBDV）结构蛋白VP3及其突变体的表达纯化开题报告

 2023-02-15 10:02

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

研究意义传染性法氏囊病（Infectious bursal disease, IBD）是危害世界养禽业的主要传染病之一。

是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，该病的发病部位主要在雏鸡的中枢免疫器官―法氏囊，造成免疫抑制[1]，给养鸡业造成了巨大的经济损失。

传染性法氏囊病病毒(IBDV)属双股双节段RNA病毒,能破坏雏鸡法氏囊淋巴细胞而引起严重的免疫抑制,并可诱发多种疾病或使多种疫苗免疫失败[2]。

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2. 研究的基本内容和问题

研究目标：1. 原核表达IBDV结构蛋白VP3蛋白2. 利用原核表达构建好的载体表达VP3蛋白，进一步纯化以获得较纯的VP3蛋白研究内容：培养鸡成纤维细胞(DF-1)细胞，感染IBDV，抽提细胞总RNA并反转录。

利用IBDV VP3特异性引物扩增IBDV VP3编码区全长序列，并亚克隆到Pet28a载体上。

重组质粒测序正确后，转入到BL21表达菌里面，利用IPTG在恒温条件下诱导表达His-VP3蛋白。

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3. 研究的方法与方案

研究方法：（1）重组质粒转化（2）PCR菌液鉴定（3）VP3蛋白的诱导及初步表达（4）诱导条件的探索（5）VP3蛋白大量诱导表达（6）VP3突变体蛋白表达技术路线及实验方案：1.初步分析His-VP3的表达方式及表达量；2.摸索VP3最佳表达条件：从表达时间、IPTG浓度梯度两个方面进行实验；3.大量表达并非变性纯化His-VP3；4.大量诱导并纯化VP3突变体蛋白，His-VP3(patch)，His-VP3(KR), His-VP3△16。

可行性分析：IBDV VP3 全长ORF 777bp，编码蛋白32Kd，VP3蛋白原核表达系统的建立在国内外多个实验室已经非常成功，VP3 ORF的全长克隆目前也已经获得较大进展。

且Pet28a载体是商业化表达能力非常强的诱导表达载体，采用T7启动子严格调控，从基本的分子生物技术及国外内发展趋势来看，该课题可以较为顺利的完成。

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4. 研究创新点

特色或创新之处创新之处：VP3蛋白最佳诱导条件的探索，以及在此基础上VP3突变体的诱导表达及纯化。

5. 研究计划与进展

研究计划：培养DF-1细胞，并感染IBDV，获得感染IBDV的DF-1细胞，经过抽提细胞总RNA并反转录，设计IBDV VP3 ORF特异性引物，TA克隆获得VP3全长ORF，并定向克隆到Pet28a载体获得原核表达重组质粒，将重组质粒导入到表达菌BL21里面，在诱导剂IPTG恒温条件下诱导表达His-VP3蛋白，采用镍柱填料纯化获得His-VP3蛋白。

预期进展：2016.9细胞培养感染IBDV扩增培养2016.10-12选取培养良好扩增成功的细胞进行RNA的抽提，抽提成功后，进行反转录，设计VP3特异性引物。

进行Pet-28a-VP3载体的构建并导入表达菌内扩增表达，IPTG诱导表达His-VP3蛋白进行定性定量分析，镍柱纯化获得His-VP3蛋白。

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