APEC O78 前噬菌体蛋白的重组表达及血清制备开题报告

 2023-02-15 10:02

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

大肠杆菌是大肠埃希氏菌（Escherichia coli, E coli）的俗称，属于肠杆菌科、埃希氏菌属的成员,是1885年德国细菌学家Theodor Escherich首次于从婴儿粪便中分离得来，由此得名大肠埃希氏菌[1]。禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichiacoli, APEC)可引起禽类的心包炎、肝周炎、腹膜炎、气囊炎、输卵管炎、滑膜炎以及败血症等多种疾病, 目前严重危害养禽业 [23]。自1894 年首次报道了鸡大肠杆菌病以来，世界许多养禽国家和地区都陆续报道了本病的发生［4］。

大部分大肠杆菌属于哺乳动物和禽类肠道内的正常菌群，少数大肠杆菌具有致病性，称之为致病性大肠杆菌 (Pathogenic E.Coli)。根据毒力因子、发病机制及病变的不同，大肠杆菌可分为肠道致病性大肠杆菌(Intestinal Pathogenic E.Coli)和肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli，ExPEc)[5] 。大肠杆菌抗原主要有菌体抗原（O）、荚膜抗原（K）、鞭毛抗原（H）、菌毛抗原（F）四种。已经确定的O抗原有173种，K抗原80种，H抗原56种，F抗原不17少于种。由于大肠杆菌抗原种类繁多，自然界中可能存在的血清型可高达上万种，但是禽致病性大肠杆菌的血清型数量有限。[6] 现在大多数国家和地区的流行血清型为O78：K80、O1：K1、O2：K1和O35。[7、8、9]1894年 ligniers首次报道了鸡大肠杆菌病，随后世界许多国家和地区逐渐有了关于该病不同病型的报道[10]。该病是 2至 12周龄鸡或火鸡的一种常见传染病[11]， 一旦发生全身性系统感染，则很可能会给养禽业的带来毁灭性的经济损失。有研究表明，禽源和人源大肠杆菌在基因组结构上很相似，且具有很高的同源性；在遗传进化和生态分布中也有较高相似性[12]，2010年，Tivendale 等[13]试验证明APEC也可引起包括人在内的哺乳动物疾病，表明 APEC亦是人兽共患病的潜在病原体越来越多的证据显示 APEC对人类公共健康造成了更大的潜在威胁，因此对APEC的调查和研究，具有重大的现实意义。

DNA测序技术在各研究领域的普遍应用，微生物基因组序列测序后,仍有 大量的基因组编码区的基因功能未知，对这些未知功能的基因进行鉴定，可以挖掘到在生物体生命活动中起重要作用的新的因子，这在一定程度上对基因组的深入研究具有更重要的意义。

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2. 研究的基本内容和问题

通过基因组比较得出了，APEC O78和DE099有两个噬菌体共有基因 AGC87669.1-phage encoded lysozyme和AGC87680.1-putative integrase(NCBI上200多株全基因组测序的E.coli全都没有)，对其编码的蛋白进行免疫原性分析，评价其免疫保护效果及作为候选疫苗的潜力。

研究内容：

一)通过PCR检测其它O78型的APEC里有没有这两个基因，其它O78型菌株： DE001B， E937，E940，DE95，DE099，DE050B。

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3. 研究的方法与方案

一）PCR检测两种噬菌体共有基因的方法：

通过聚合酶链式反应（PCR体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一）。（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。

1）试剂准备1.DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10PCRBuffer4．2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．Taq酶。

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4. 研究创新点

就目前来看国内外关于禽致病性大肠杆菌前噬菌体基因的报道还是比较少。本试验首次对禽致病性大肠杆菌的前噬菌体基因表达的蛋白的免疫原性进行分析及研究，探索前噬菌体对禽大肠杆菌的影响，为禽致病性大肠杆菌的噬菌体制剂的研究提供参考。

5. 研究计划与进展

（1）2016年9月

实验准备

（2）2016年10月

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