1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
保护环境是建设美丽乡村、绿色乡镇、和谐宜居城市的重要内容，加强城市公园绿地等生态设施建设，充分开发利用城市工业与生活废水的循环水进行公园绿地灌溉为重要途径。可是循环水中盐分较高，不利于草坪草的生长，解析耐盐草坪草耐盐分子机制不仅可为耐盐草坪草新种质培育提供新思路，同时可为耐盐草坪转基因育种提供优异的基因资源，丰富耐盐草坪植物种类，促进盐渍化土地绿化建设和生态建设。深入解析海滨雀稗耐盐的分子机制不仅能解释其高耐盐的内在本质，同时能为其它草坪草的耐盐定向育种提供优异基因资源。
海滨雀稗生长于南、北纬30o之间的沿海地带，源于非洲和美洲，曾作为饲料、草坪和改良受盐碱影响的土壤的草种，以能适应各种非常恶劣的环境而闻名。其耐盐阈值（261 mM）显著高于结缕草（203 mM）、狗牙根（135 mM）、假俭草（131 mM）1。在耐盐生理机制上主要通过渗透调节、离子平衡、水分吸收、光合响应等途径来缓解盐害，研究发现，不同浓度盐胁迫对海滨雀稗各器官的抑制程度不同，各器官干重均呈下降趋势。当NaCl浓度达到300mmol/L时，盐胁迫对海滨雀稗的根、茎和叶干重具有明显的抑制作用。随着NaCl浓度的增加，海滨雀稗体内的盐积累量也增加，致使活性氧平衡系统遭到破坏，使其酶活性下降，造成过剩的活性氧不能及时清除，导致海滨雀稗对盐害的防御能力下降2。1967年,Moore和Perez等最早在牛脑细胞中发现一种酸性的可溶异源二聚体蛋白,命名为14-3-33。在植物中,14-3-3蛋白是基础代谢和膜转运的重要调控因子。近来的研究表明不同14-3-3蛋白对靶蛋白的调控有较强的特异性4。随着拟南芥基因组测序的完成,14-3-3基因家族在拟南芥中相对较多,共有13个蛋白成员。14-3-3蛋白也在低温胁迫、高盐胁迫、机械损伤等应答上起作用, 但目前对这些方面的认识还非常有限5。分析海滨雀稗GF14基因的耐盐功能可为耐盐草坪草新种质培育提供新思路，促进盐渍化土地绿化建设和生态建设。
参考文献：
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
本课题组研究目标为解析PvGF14的耐盐功能。
内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
本项目主要通过观察法和实验法来分析PvGF14的耐盐功能。首先利用酵母筛选体系从海滨雀稗表达文库中获得PvGF14基因，通过农杆菌介导的遗传转化体系，在拟南芥中过量表达 PvGF14，将获得的含有PvGF14基因的拟南芥种子置于不同浓度梯度的NaCl培养基中,经过培养来观察种子的生长情况，记录每一个种子的根长，然后将种子移栽至盆中进行盆栽实验，经过15D左右的生长，测量其莲座丛直径，然后用盐水处理，来观察生长情况。最后进行分析其耐盐功能。
本项目研究方案技术路线如下图所示：
实验方案：
海滨雀稗 PvGF14 耐盐功能鉴定
①PvGF14 转基因表达载体构建：以前期工作中获得的耐盐基因 PvGF14 序列为
基础，设计全长 ORF 引物，以海滨雀稗叶片 cDNA 为模板，高保真酶 Q5 进行PCR
扩增、酶切、连接获得 pENTR1A-PvGF14 入门载体、pENTR1A-PvGF14 质粒经内切酶 NsiⅠ线性化后与 pVT1629 载体进行 LR 重组获得 pVT1629-PvGF14 过量表达载体。并将表达载体转入农杆菌 EHA105。
②农杆菌介导拟南芥遗传转化：参照本课题组前期实验总结的方法，利用花粉管介导法转化“哥伦比亚型”拟南芥，通过农杆菌将 PvGF14 过量表达载体转化拟南芥，经养护、抗性筛选、获得T0代转基因株系，进一步收取获得T1代种子；采用 PCR、RT-PCR、Southern 杂交技术鉴定转基因株系，用于下一步耐盐鉴定。
③转基因拟南芥株系耐盐鉴定：采用平板播种法对T1代种子进行培养14d，观察盐胁迫下的转基因株系萌发和生长差异。将野生型拟南芥和转基因株系同时播种在0、40、80、120、160mMNacl平板上，观察萌发及幼苗生长期间的差异，记录每一株幼苗的根长，然后采用土培法将种子移栽至盆中进行培养并用300 mM NaCl 处理 1、7、14 d，计算植株生物量和 ICP 法测定离子含量。测定根系活力、叶绿素含量、相对含水量、光合速率、光化学效率等生理生化指标。
可行性分析：
本项目组掌握了完成本研究的相关实验技术
本项目组以南京农业大学草业学院“草类植物逆境生理生化和分子生物学实验室”为依托，多年来一直从事草类植物逆境生理和分子生物学研究，建立了农杆菌介导的海滨雀稗遗传转化技术体系，已成功应用于海滨雀稗遗传转化中。同时，本课组相关成员掌握了基因克隆及功能分析、酵母单杂双杂、蛋白质免疫共沉淀、双分子荧光互补等分子生物学研究方法。这些研究技术是目前在非模式植物中研究抗逆调节分子机制最有效的方法，为本项目的顺利完成提供了完备的技术体系。
4. 研究创新点
（1）研究材料独特：海滨雀稗是耐盐性最强的暖季型草坪草。本项目将率先揭示其特异耐盐性分子调控网络。
（2）研究方向新颖：14-3-3 蛋白是植物生长发育和非生物胁迫响应中的重要调节分子，而正调控植物耐盐性的 14-3-3 蛋白未见报道。本课题组前期通过文库筛选，克隆到一个正调控耐盐性的海滨雀稗 14-3-3 家族蛋白成员 PvGF14。本项目将率先明确PvGF14 调控植物耐盐性的新功能。
5. 研究计划与进展
（1）2018.7-2018.12：
a、以拟南芥种子为外植体，诱导培养胚性愈伤组织，利用农杆菌介导法转化拟南芥并获得过量表达和PvGF14 转基因植株；
b、提取、分离拟南芥根、叶 mRNA，构建海滨雀稗 cDNA 三框酵母双杂交文库构建，以拟南芥 PvGF14 为诱饵蛋白，筛选和鉴定与其互作的靶蛋白 X；
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