1. 研究目的与意义
保健食品灵芝孢子粉是公司准备备案的产品，灵芝中所含有的三萜类化合物是主要的活性物质之一，具有保肝、抗肿瘤、消炎抗菌、抗衰老等多种生理功能。市场上很多灵芝产品常以总三萜含量作为功效成分指标，但总三萜的定量检测一直没有统一的国家标准。各企业及食品行业检测方法均有所不同，在检测过程中发现三萜含量测定重现性较差，受标准液取样体积、样品浓度、检测时间、样品处理方法等条件影响较大，希望总结原因，通过对一些影响条件的进一步优化，形成一个简便、快速、准确、重复性好的灵芝孢子粉总三萜含量测定方法，从而形成企业标准，以便社会抽检和第三方检验时不会产生争议，保护公司利益，和客户利益。
2. 文献综述
灵芝孢子粉总三萜含量的测定的研究进展
摘要：目的是研究林芝三萜最佳提取方法和建立灵芝孢子粉总三萜含量测定的方法。采用正交实验方法，用硅胶柱进行总三萜分离，通过紫外-可见分光光度法测定总三萜含量。
关键词：灵芝孢子粉；总三萜；提取；含量测定
灵芝孢子为多孔菌科真菌赤芝的子实体发育后期弹射释放出的种子,是灵芝的生殖细胞。孢子内含有脂肪油、三萜酸类、多糖等。近代药理研究证明灵芝破壁孢子粉有抗肿瘤、增强免疫、降血糖、降血 脂、镇静、清除自由基、抗辐射、促进新陈代谢、延缓衰老等作用,而灵芝三萜类化合物涵盖了绝大部分孢子粉的药理活性，但是三萜类成分复杂，曾祥丽等 报道灵芝含有 122 种三萜类成分，其中最主要是灵芝酸 37 种。林志彬等研究认为灵芝三萜具有抗 HIV-1 及 HIV-1 蛋白酶活性、保肝、抗肿瘤和抗艾滋病毒等药理活性 。因此我们进行三萜的提取分离和总三萜的含量测定。
1.灵芝三萜及其药理作用
三萜是在灵芝中发现的一类三萜类化合物，也就是说灵芝三萜是灵芝的主要化学和药效成分。
1.1灵芝三萜药理作用
1.1.1抗肿瘤
灵芝三萜对多种肿瘤细胞的生长和转移都有抑制作用。Toth等首先报道了灵芝三萜类化合物的药理活性。作者从赤芝菌丝体中提取得到6个有细胞毒活性的三萜类化合物ganodericacidU ，V ，W ，X ， Y和Z ，体外实验表明能明显抑制小鼠肝肉瘤(HTC)细胞的增殖。Lin等[ 17 ]从赤芝子实体中分离到2个三萜类化合物灵芝醛A和双氢灵芝醛A ，体外实验表明两者有较强的抑瘤活性，对人肝肉瘤细胞和KB细胞ED50值均在1～11μgmL- 1，以灵芝醛A作用最强。
1.1.2抗病毒
灵芝酮对单独疱疹病毒有抑制作用。Min等从赤芝孢子粉中分离得到ganoderic acidβ，lucidumol B ，ganodermanondiol ， ganodermanontriol和ganolucidicacidA。体外试验表明对HIV21蛋白酶活性有明显抑制作用，其IC50分别为20 ，50 ，90 ，70和70μmolL- 1;此外，ganoderic acid A ，ganoderic acid B 和ganoderic acidC1亦有中的抑制作用。
1.1.3降血脂
灵芝醇A,灵芝醇B,灵芝醛A,灵芝酸Y这类物质具有抑制人肝细胞株合成胆固醇的生物效应，灵芝中氧合的固醇抑制胆固醇的生物合成是通过胆固醇的前体醋酸或甲羟戊酸的转变实现的。
1.1.4抗炎症反应
灵芝三萜中的某些化合物对由中性粒细胞等释放的炎症介质有抑制作用。
1.1.5免疫调节
灵芝醇F，灵芝酮二醇,灵芝酮三醇能够有效地抑制补体激活的经典途经。
1.1.6对血小板聚集的影响
Su 等报道ganodermic acid S (GAS ，化学名：lanosta27,9(11) ，242triene23β,15α2diacetoxy2262oic acid)对TXA2 在人源血小板中信号传导途径的影响。发现GAS对TXA2 拟似物U46619所诱导的人源硅胶过滤处理的血小板(GFP)聚集具有明显抑制作用，可延迟血小板发生形态改变的时间，减少血小板的初始聚集并降低其聚集百分率，该抑制作用有剂量依赖性。
1.1.7抑制真核细胞D NA多聚酶活性
izushina等从赤芝中分离得到2个新三萜类化合物lucidenic acid O 和lucidenic lactone ，两者在体外对真核细胞DNA多聚酶的活性都有选择性抑制作用。
2.提取方法
灵芝三萜属于脂溶性物质，常用有机溶剂进行提取。提取方法有有机溶剂回流,浸渍提取,超声提取和薄层色谱法。
2.1有机溶剂回流，浸提提取法
运用三萜溶于有些有机溶剂，使三萜装到溶剂中，从而除去不溶性杂质。
2.2超声提取法
利用超声波产生强烈振荡，高速在溶剂和样品之间产生声波空化作用，导致溶液内气泡的形成，增长和破爆压缩，破坏植物药材的细胞，使溶剂能渗透到药材细胞中，提高目标物从固相转移到液相的传质速率。
2.3层色谱法
不同化学成分对同一溶剂的溶解性不同，所以扩放速度也不同。
3.影响因素
灵芝孢子粉三萜的提取受很多因素的影响,实验可从提取溶剂、提取次数、时间及其用量 4 个试验因素来考虑。
影响因素 | 1 | 提取溶剂 |
2 | 提取时间 | |
3 | 提取次数 | |
4 | 溶剂用量 |
4.灵芝孢子粉总三萜含量的测定
灵芝孢子粉总三萜含量的测定采用紫外分光光度法
4.1标准品溶液的制备
精密称取熊果酸标准品 10.0mg, 定容至100ml容量瓶中，即得 0.100mg/ml 熊果酸标准品溶液。
4.2样品溶液制备
准确称取破壁灵芝孢子粉0.5g,加溶剂 80ml, 进行提取 , 冷却后过滤，提取液定容至 100ml，即得样品溶液。
4.3取标准溶液
0.0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、 0.8ml、1.0ml；样品液 0.3ml 蒸干溶剂后，加入一定量的 5% 香草醛 冰乙酸溶液和高氯酸，在一定温度下水浴加热一定时间后，移入冰水浴 中，放置室温后加入 5.00ml 冰乙酸，摇匀后在 548nm 处测定溶液吸光度 。
4.4结果与分析
Ⅰ提取溶剂和提取条件的选择
a.提取溶剂的选择
以无水乙醇，甲醇，乙酸乙酯，三氯甲烷 分别为溶剂
b.提取条件与提取时间的选择
以无水乙醇为溶剂，分别通过索氏提取和超声提取两种不同的提取方式，对其时间进行梯度试验.
Ⅱ蒸干方式的选择
以无水乙醇为溶剂，超声提取1h，分别进行沸水浴蒸干，60℃减压旋转蒸干，75℃热风干燥蒸干，以Ⅰa检测条件进行实验，比较其吸光度。
Ⅲ显色剂使用的选择
a. 5% 香草醛 - 冰乙酸用量考察
按照实验方法进行样品处理，改变 5% 香草醛 - 冰乙酸的用量，测定其吸光度。
b. 高氯酸用量考察
按照Ⅱ实验方法进行样品处理，改变高氯酸的用量，测定其吸光度。
Ⅳ水浴条件的考察
a.水浴温度的考察
按照Ⅱ实验方法进行样品处理，改变水浴温度，测定其吸光度。
b.水浴时间的考察
按照Ⅱ实验方法进行样品处理，改变水浴时间，测定其吸光度。
影响因素 | 1 | 提取溶剂（无水乙醇，甲醇，乙酸乙酯，三氯甲烷） |
2 | 提取条件（索氏提取和超声提取） | |
3 | 提取时间 | |
4 | 蒸干方式的选择（沸水浴蒸干，减压蒸干，干燥蒸干） | |
5 | 显色剂使用的选择（5% 香草醛 - 冰乙酸，高氯酸） | |
6 | 水浴温度 | |
7 | 水浴时间 |
Ⅶ正交分析
根据Ⅲ试验结果，对检测中四个重要的因素：5% 香草醛 - 冰乙酸用量，高氯酸用量，水浴温度，水浴时间需进行进一步的分析。
a.线性关系试验
按单因素实验及正交实验最优组合进行实验，在 548nm 处测定标准品溶液吸光度，以熊果酸的称样量为横坐标，吸光度为纵坐标，画图分析。
b.重复性试验
相同的方法，同一试验材料，在相同的条件下获得的一系列结果之间的一致程度。
c.稳定性试验
考察原料药或者药物制剂在温度，湿度，光线等影响下随时间变化规律的试验方法。进行影响因素试验，加速试验，长期试验。
d.回收率试验
考察经过样品处理后能用于分析的药物的比例，验证测定方法的准确性。
5.讨论
a.蒸干过程文献资料均为加热 ，但对其具体条件并无控制， 从水浴蒸干、烘箱干燥蒸干、以及减压蒸干三方面进行探讨，比较不同挥干方式对实验结果的影响。
b.由于缺乏灵芝三萜类单体即四环三萜类作为对照品，大多只能以常见的五环三萜类熊果酸或齐墩果酸作为对照品，并无法真实的反应总三萜的含量，随着分离提取技术的不断发展，可采用结构较为一致的三萜酸类作为对照品，进行含量测定 。
6.展望
作为有悠久药用历史的中药灵芝，是我国中医药学的珍宝，具有广泛的生物活性，灵芝所含的三萜类化合物结构复杂，分子中功能基团较多，目前只有少数化合物进行了药理研究，因此我们有必要采取现代科学的实验方法对其药理作用，构效关系，作用机制进行分析研究。
参考文献
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3. 设计方案和技术路线
1、从不同的样品处理方法中选择操作简洁、快速的方法。
2、针对影响三萜含量测定的不同因素，寻找摸索、优化最佳条件。
3、形成企业试行标准，送第三方检测进行检测，对两者的结果进行比较并且分析原因。
4. 工作计划
1、2月17-28日购买不同厂家的灵芝孢子粉并筛选样品不同的处理方法。
2、3月1 -31日使用不同厂家和食品行业标准进行检测并从中摸索影响三萜含量的测定因素并优化检测条件。
3、4月1-30日将灵芝孢子粉及公司优化后的试行标准送第三方检验机构进行检验。
5. 难点与创新点
在使用已有的检测方法，寻求新的检测方法，并对已有的其他厂家及行业检测方法进行多次试验，比较分析结果，对实验操作方法及过程进行优化，目的找到一个简便、快速、准确、重现性好的灵芝孢子粉总三萜含量的检测方法。
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