1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
玉米是重要的粮食作物，在我国播种面积仅次于小麦、水稻居第三位，同时也是重要的饲料和工业加工原料。随着人口的不断增多，玉米播种面积的不断提高，然而玉米的生产质量受到诸多病害的威胁[1]，而对病害的发生和流行会造成某种程度的失控，导致病害流行更加严重。目前玉米病害整体防治方法有农业防治、生物防治、物理防治、化学防治等[2]。有关玉米抗病基因的发掘及遗传育种方面的研究面临极大的挑战，进程比较缓慢。近年来基因组学研究及其技术的飞速发展给玉米顶腐病抗性研究机制带来了新的研究思路与方法。病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）最早用于描述植物受病毒侵染后的症状恢复现象[3]，后来VIGS 专门用于指通过重组病毒来沉默植物内源基因的反向遗传学技术[4]. 。VIGS已被广泛用于表征多种植物物种的基因功能超过十年，是一种瞬时基因沉默的快速、高效和特异的系统[5], 它是利用携带目的基因cDNA 片段的病毒载体侵染植株，随着病毒的复制和转录而特异性地诱导序列同源基因 mRNA降解或被甲基化等修饰，从而引起植物表型或生理指标变化，实现对该功能基因的鉴定[6]。其不需要遗传转化获取转基因植株，操作简单，具有速度快、成本低、高通量等优势，因而成为功能基因组学研究领域最具吸引力的技术手段之一。
目前，VIGS 体系不仅在模式植物如本氏烟、拟南芥上成功建立，在小麦、玉米、水稻、番茄、葡萄、苹果、柑橘等作物上的应用也有报道。大约有37个VIGS载体可以用于双子叶植物基因功能的研究，但极少数载体可用于单子叶植物的基因功能研究[7-9]。研究表明，利用BSMV-VIGS技术已经可以成功地把小麦中基因沉默，如TNBL1、Bsr1、TiRB等多个抗病相关基因[10]。有研究表明TRV-VIGS介导的基因沉默体系在新疆陆地棉上的建立[11]，2016年郑娜等通过VIGS技术研究棉花抗黄萎病[12]。少量文章报道过BMV、CMV和FoMV病毒可以侵染玉米并能诱导玉米基因沉默，但是三者的沉默效率均依赖于体外转录或者本氏烟的预感染，并且沉默八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因只能引起玉米植株出现局部白化，这限制了其广泛地应用于玉米基因功能的验证分析。其中成功应用于玉米的VIGS载体只有雀麦花叶病毒（Brome mosaic virus，BMV）[13]、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）[14]、狐尾草花叶病毒（Foxtailmosaic virus，FoMV）[15,16]和烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）等。采用BMV、CMV和FoMV病毒沉默载体时，往往需要采用体外转录合成RNA直接接种玉米，或者先接种烟草或其它中介宿主植物，从中提取组装好的病毒再接种玉米。一般需要采用摩擦接种法[17]，存在体外转录RNA产量低、成本高、容易降解，摩擦接种不容易掌握，摩擦过度易损伤叶片，摩擦不够不易接种成功[18]等问题。TRV病毒因具有沉默效率高、引起寄主病毒症状轻等优点，使得它成为玉米VIGS体系新的候选病毒载体。PDS是植物类胡萝卜素代谢途径中的限速酶，被沉默后植株会表现出光漂白症状。Ratcliff等和Liu等通过TRV载体成功沉默PDS基因，表现出光漂白现象；Zhang等利用TRV载体也成功沉默了小麦中的PDS基因采用这种方法沉默八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因只能引起玉米叶片局部条纹化白化。少量文章报道过BMV、CMV和FoMV病毒可以侵染玉米并能诱导玉米基因沉默，但是三者的沉默效率均依赖于体外转录或者本氏烟的预感染，并且沉默八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因只能引起玉米植株出现局部白化，这限制了其广泛地应用于玉米基因功能的验证分析。Zhang等[19]利用TRV载体通过真空辅助农杆菌渗入及共培养的方法，无需RNA操作，无需接种，沉默PDS基因可使植株玉米整株白化，沉默效果好、持续时间更长。然而，TRV-VIGS的沉默效率能否满足大规模功能基因筛选的需求？影响玉米TRV-VIGS沉默效率的因素有哪些？以及如何优化等需求进一步研究。
本研究拟利用TRV病毒载体，以玉米PDS基因为沉默对象，构建重组沉默载体，通过真空辅助农杆菌侵染玉米种子，在玉米上实现病毒诱导的基因沉默，通过改变实验中不同参数研究其对玉米VIGS体系的影响，建立一个最佳的快速研究分析玉米重要基因功能的VIGS体系。然后从先玉335和郑单958接种玉米病菌后差异表达基因中挑选2-3个抗病相关基因，分别对这些基因进行VIGS干扰，对干扰植株中靶基因表达水平、玉米感病性综合表现进行分析，从而初步确定基因的功能，为玉米相关病害的分子机理研究以及抗病的分子育种奠定基础。
2. 研究的基本内容和问题
1.1研究目标
① 进一步优化玉米VIGS技术体系，使干扰比例达到50%以上
② 应用VIGS技术初步鉴定玉米抗病相关基因在玉米病抗性中的作用。
3. 研究的方法与方案
2.1拟采用的研究方法
① VIGS-TRV和VIGS-CMV技术。
烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)诱导的基因沉默，作为功能基因组的鉴定手段具有重要意义。目前,许多表现型引起关注的基因只能通过大规模筛选群体来筛选特定基因中的突变体，同时在多个物种中传代转化的方法进行鉴定; 而VIGS 克服了传统转化方法所带来的诸多困难，能够鉴别当代植株特定基因功能缺失的表现型，直接靶定受关注的基因，使得具有特别意义的基因能够快速通过VIGS载体测序和鉴定
② 玉米顶腐病病原菌接种及其抗病性鉴定
2.2技术路线
2.3可行性分析
本项目承担的实验室近三年来在玉米顶腐病抗病性鉴定、VIGS技术应用等方面进行了大量的试验，并取得了良好的研究进展，为本项目的实施奠定了坚实的基础，在相关抗病实验中可以借鉴抗顶腐病的实验方法。不存在任何技术障碍，主要研究内容和方法都是根据实验室现有技术基础设计，是切实可行的。但是由于许多实验操作比较精细，需要特别注意以下实验技能的培养和提高：
①在借助体视显微镜直接观察病原菌在感病玉米叶、茎和根表面的侵染及扩展过程中，需要使用无菌双面刀片对不同接菌时间取样的玉米株的叶片、根部和茎部组织进行徒手切片时，应注意切片要足够的薄，以便于观察病原菌在茎和根内部的扩展情况。使用机器切片无法达到观察所需的薄的程度，而徒手也较难切出薄片，因此需要对此操作多加练习。
②构建pTRV-VIGS载体时，选择合适的目的基因区域插入载体，插入载体的目的基因片段的大小要适中，以300~500bp为宜，过长或过短都不利于基因的沉默，靶标序列的选取需要运用有关生物信息学分析工具，需要加强学习。
4. 研究创新点
VIGS技术是一种RNA介导的抗病毒防御反应机制，目前在植物反向遗传学领域已经表现出巨大潜力。然而目前VIGS体系应用中对玉米的研究甚少。因此我们对于玉米VIGS技术的研究一种方法的创新。
玉米顶腐病相关基因及其功能的研究报道较少，开展这方面的研究将有利于
并尝试采用真空辅助侵入法使用真空干燥器抽真空产生压力，时间为60min。 将所得制备物倒回组培瓶中并在摇床中在28℃，180rpm下共培养一段预选的共培养时间10h。 共培养结束后，农杆菌渗透的种子用无菌水洗涤5次以除去表面吸附的农杆菌菌液并播种于土壤中生长。
5. 研究计划与进展
2019年8月-2020年1月 玉米VIGS体系的构建及优化；
2018年1月-2018年3月生物信息学分析受相关病害诱导的转录组数据库，筛选候选基因；
2018年3月-2018年4月VIGS相关载体苗期基因进行干扰鉴定，以及qRT-PCR。
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