3-塔格糖差向异构酶的固定化酶制备及其催化条件研究开题报告

 2024-01-02 10:01

1. 研究目的与意义

1.1研究背景：
塔格糖（tagatose）是一种六碳单糖，与葡萄糖结构类似，但其构象与葡萄糖不同，可以由D-塔格糖 3-差向异构酶（D-tagatose 3-epimerase，DTE）催化制备。塔格糖差向异构酶能够将D-半乳糖转化为D-塔格糖，也可以将D-塔格糖转化为D-半乳糖。
酶固定化技术即是用载体材料将酶束缚或限制在一定的空间内，保留其催化活性，并可回收及重复使用的一类技术。其中包含物理吸附法、共价结合法、包埋法、交联法。其中吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式，是目前制备固定化酶方法中最有效简便、易操作的固定化方法。其显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。
PDA是近年来受到广泛关注的高分子材料。作为广泛分布于人体的黑色素的重要组成成分，PDA在生物安全性方面具有明显优势。研究显示PDA并不干扰大部分哺乳动物细胞的活性和增殖能力，即使在高剂量下，也不会产生明显的细胞毒性。更重要的是，PDA已被证实在体内可完全降解，相比其它共轭聚合物具有更高的安全性。在光学性质方面，PDA具有与黑色素相似的光吸收性能，其在紫外光到可见光的范围内有宽波段的吸收，并且光吸收一直延伸近红外区域。众多研究表明PDA的易氧化自聚特性可做酶固定化敷料，安全可靠。
1.2研究目的：
（一）3-塔格糖差向异构酶的酶学性质研究。
（二）探究3-塔格糖差向异构酶固定化方案。
（三）3-塔格糖差向异构酶固定化酶催化条件优化。
1.3研究意义：
3-塔格糖差向异构酶广泛存在于许多微生物中，包括肠道菌、嗜酸乳杆菌、拟杆菌、乳酸杆菌等。这些微生物利用3-塔格糖差向异构酶将半乳糖代谢途径与戊糖代谢途径连接起来，从而实现对塔格糖的生物合成和降解。
在分子水平上，3-塔格糖差向异构酶的基因结构和编码方式已经得到了充分的研究，但对其稀有糖产物的研究较少。此外，已经开发出了许多高效的表达系统和纯化方法，以获得高纯度的酶。近些年来，基因工程和蛋白质工程技术的发展使得3-塔格糖差向异构酶可以通过改变酶的特性以实现更高的催化效率和选择性。
3-塔格糖差向异构酶的应用逐渐成为了研究热点。除了生产塔格糖外，它还可以用于制备其他功能性糖类化合物，如预生物纤维素和低聚果糖等；3-塔格糖差向异构酶还可以用于生产高纯度的D-半乳糖，为乳糖不耐受患者提供了一种可行的替代品。
综上所述，3-塔格糖差向异构酶在生物学、生物技术和食品工业等领域中都具有重要的应用价值，未来还有许多值得深入研究的内容。

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2. 研究内容和预期目标

2.1主要研究内容：
本研究立足于国内外研究现状，制备3-塔格糖差向异构酶的固定化酶，催化果糖制备生产稀有糖阿洛酮糖，优化固定化酶催化条件。

具体研究内容如下：
（1）制备固定化3-塔格糖差向异构酶，探索固定材料量与酶量之比；
（2）探索固定化单酶的最适底物浓度及催化条件，包括最适底物浓度、最适pH、最适反应温度等条件的探索；
（3）通过高效液相色谱仪法测定产物含量，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；
（4）绘制果糖、蛋白质标准曲线。



2.2预期目标：
（1）完成3-塔格糖差向异构酶的提取与纯化
（2）完成3-塔格糖差向异构酶的固定化
（3）完成3-塔格糖差向异构酶固定化酶在不同离子液体中的表现，酶促动力学，失活动力学以及温度耐受的数据记录、处理及分析。

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3. 研究的方法与步骤

3.1 3-塔格糖差向异构酶诱导表达及纯化
将甘油管保存的原始菌株接种于含卡那霉素的培养液中，37℃，200 rpm活化培养12 - 16 h；接种1%到新LB培养基中，37℃，200 rpm培养至菌体浓度OD600约为0.6时，添加IPTG至0.1 mM，20℃，200 rpm培养20 h诱导蛋白表达；将50 ml菌液于8000 rpm，4℃离心10 min去除上清，并用PBS清洗数次；加入3 - 5 ml裂解液，重悬后置于冰上超声破碎15 min（工作2 s，间隙3 s，功率650 w 55%），溶液变澄清透明后12000 rpm，4℃离心20 min后取得的上清液即为粗酶液。


由于粗酶液中仍有部分大肠杆菌代谢产生的蛋白，对取得的粗酶液进行纯化以降低溶液中杂蛋白的影响。

采用BeyoGold#8482; His-tag Purification Resin进行纯化，取800 μl镍柱离心弃上清，再用裂解液或PBS清洗数次平衡凝胶；清洗后的凝胶加入3 - 5 ml粗酶液中4℃侧摇3 h；将混合液加入亲和层析柱，5倍柱体积洗涤液清洗后，梯度洗脱目的蛋白，4℃保存。

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4. 参考文献

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[2] Takeshita K , Suga A , Takada G , et al. Mass production of D-psicose from d-fructose by a continuous bioreactor system using immobilized D-tagatose 3-epimerase.[J]. Journal of Bioscience amp; Bioengineering, 2000, 90(4):453-455.
[3] Cheng W , Li Y , Li X , et al. Preparation and characterization of PDA/SiO2 nanofilm constructed macroporous monolith and its application in lipase immobilization[J]. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 2019, 104.
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5. 计划与进度安排

（1）2024-03-01～2024-03-12：查阅资料撰写开题报告；
（2）2024-03-12～2024-03-18：培养大肠杆菌，纯化3-塔各糖异构酶，制备固定化酶；
（3）2024-03-19～2024-04-15：探索固定化单酶的最适底物浓度及催化条件；
（4）2024-04-16～2024-04-22：通过高效液相色谱测定还原糖含量，考马斯亮蓝法测蛋白质含量；
（5）2024-04-23～2024-05-17：绘制还原糖、蛋白质标准曲线。


（6）2024-05-18～2024-06-01：分析实验结果，整理实验数据。


（7）2024-06-03～：撰写论文，英文翻译，修改补充论文，准备答辩。

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